HPV GENOTİPLENDİRMEDE KULLANILAN
YÖNTEMLERDEN KAYNAKLANAN SORUNLAR VE
TARTIŞMALAR
Paşa GÖKTAŞ, Şafak GÖKTAŞ, Nilay MALKOÇ
Gelişim Tıp Laboratuvarları Moleküler Mikrobiyoloji Ünitesi,
Kızıltoprak, İSTANBUL
4.06.2018
AMAÇ
Hekimler ve hastalar arasında en çok tartışma ve polemik konularından birisi olan HPV genotiplendirme ile ilgili tartışmalara katkı sunabilmektir.
HUMAN PAPILLOMA VIRUS
HPV 200’den fazla değişik tipi olan Papovavirus ailesine üyedir.
120’den fazla değişik HPV tipi saptanmıştır.
40’dan fazla HPV tipi cinsel yolla bulaşır.
Cinsel olarak aktif erkeklerin %90’ı, kadınların %80’i hayatboyu en az 1 HPV ile enfekte olurlar.
Bu infeksiyonların yarısı yüksek riskli HPV’dir.
Çoğu HPV infeksiyonu (yüksek riskliler dahil) belirti göstermez, 1-2 yıl vücutta kalabilir ve kaybolur.
Kaynak: NIH-National Cancer Institute; WHO-IARC
HPV Prevalansı
Meta analiz: 36 ülke, 157879 normal sitolojiye sahip kadın
: IARC 2012; de Sanjosé et al., 2007
HPV ve KANSER
HPV tüm kanser vakalarının %5’inden sorumludur.
Servikal kanser: Neredeyse tamamı HPV kaynaklıdır.
Anal kanser: >%95’ i HPV tip16 kaynaklıdır.
Oropharyngeal kanser: >%70’i HPV kaynaklıdır. Yarısı HPV tip16.
Nadir kanserler: Vajinal kanserin %65’i, vulvar kanserin %50’si ve penile kanserin %35’i HPV kaynaklıdır. En yaygın HPV tip16.
: NIH-National Cancer Institute; WHO-IARC
HPV ve KANSER
HPV tip 9 ve 11: Genital ve anal bolgede görülen condylomata acuminata’nın >%90’ dan sorumludur.
HPV tip 16 ve 18: HPV kaynaklı Kanserin >%70’den fazlasından sorumludur.
: NIH-National Cancer Institute; WHO-IARC
HPV Tiplerinin Sınıflandırılması
Sınıflandırma HPV tipleri
Grup 1 Yüksek risk 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59
Grup 2A Olası kanserojenik (yüksek risk) 68
Grup 2B Olası kanserojenik (intermediate risk) 26, 53, 66 a, 67, 70, 73, 82
Grup 2B Bilinmeyen risk b 30, (34), 69, (85), 86, (97)
Grup 3 Düşük risk 6, 11, 40, 42, 43, (44), 54, 61, (71), (72), 81,
89, 90 c
Not : IARC 2012’de belirtilen ancak bilinmeyen ya da düşük risk olarak sınıflandırılan HPV 74, 83, 87, 91
(a) IARC 2007’de kanserojenik (yüksek risk)
(b) Filogenetik bilgilere göre
(c) IARC 2012’de belirtilmemiş
(IARC: International Agengy for Research on Cancer)
HPV GENOMU ve TİPLENDİRME
Genom: 8kb halkasal DNA 6 early protein (E1-E7)
HPV replikasyonu
p53 yıkımı ve Rb inaktivasyonu
EGFR ve PI3/Akt yolak aktivasyonu
2 late protein (L1-L2)
Viral capsid proteinleri
Genomdaki varyasyonlar incelenerek HPV tiplendirme yapılmakta ancak analiz edilen tüm bölgeler her HPV tipini ayırt edememektedir.
En sık kullanılan MY09/11 ve Gp5/6 primerleri L1-L2 bölgesine bağlanmaktadır.
GELİŞİM TIP LABORATUVARLARI ve HPV
4.06.2018
YÖNTEM:
HPV Genotipleme için yapılan örnek çalışma
Laboratuvarımızda HPV genotipleme için 3 ayrı yöntem kullanılmaktadır;
f HPV typingTM fragman Kiti
HPV-QUANT-21®Kantitatif Real Time PCR kiti
DNA Dizi analizi
2016 Kasım ayında, HPV genotiplendirme istemiyle gönderilen rastgele 110 örnek seçilmiştir
HPV pozitifliği kıyaslaması
HPV genotipleme kıyaslaması yapılmıştır.
YÖNTEM:
Kullanılan Genotipleme Kitleri
f HPV typingTMfragman Kiti:
HPV genomu E6 –E7 bölgesine bağlanan florasanlı primerlerle yapilan multipleks PCR ürünleri ABI fragman analizi ile değerlendirilmekte.
16 HPV tipi: HPV tip 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 ve 68.
DNA dizi analizi:
HPV genomu L1-L2 bölgesine bağlanan primerlerle yapilan PCR ürünleri ABI DNA dizi analizi ile değerlendirilmekte.
Teorik olarak TÜM HPV tiplerini kapsamaktadır.
HPV-QUANT-21®Kantitatif Real Time PCR kiti:
Kantitatif sonuç vermekte.
21 HPV tipi: HPV tip 6, 11, 44, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82.
YÖNTEM:
ANALİZ ŞEMASI
110 Örnek*
Real Time PCR taramaHPV-QUANT-21® Kantitatif
(L1-L2 genom bölgesi)Real Time PCR kiti
Pozitif : 61 (%55.5) Pozitif : 54 (%49) (GENOTİP SAPTANDI) Negatif : 49 (%44.5) Negatif : 56 (%51) (GENOTİP NEGATİF)
15 pozitif Örnek
DNA dizi Analizi f HPV typingTM HPV-QUANT-21®
*:2016 Kasım ayında, HPV genotiplendirme istemiyle gönderilen rastgele 110 örnek seçilmiştir
BULGULAR-1
Negatif Pozitif
Real-Time PCR Tarama 49 (%44.5) 61 (%55.5)
HPV-QUANT-21® 56 (%51) 54 (%49)
Real-Time PCR Negatif 49 örnek, HPV-QUANT-21® ile de Negatif bulundu. 14 örnek Real-Time PCR ile Pozitif, HPV-QUANT-21® ile Negatif bulundu.
Tüm tipleri yakalamada Real- Time PCR tarama %100 kabul edilirse, HPV-QUANT-21®: %87.3 Duyarlı (tüm HPV tipler)
%97.0 Duyarlı (yuksek riskli HPV tipleri)
BULGULAR-2
15 HPV POZİTİF örnek için GENOTIPLEME;
DNA Dizi Analizi : 12 örnekte yüksek risk – 3 örnekte düşük risk HPV DNA dizi analizi referans yöntem olarak kabul edilirse;
HPV-QUANT-21®: %93.3 Duyarlı (tüm HPV tipleri)
%100 Duyarlı (yüksek riskli HPV tipleri)
(Yüksek risklerde 12’de 12, düşük risklerde 3’te 2 tespit)
f HPV typingTM : %86.7 Duyarlı (tüm HPV tipleri)
%91.6 Duyarlı (yuksek riskli HPV tipleri)
(Yüksek risklerde 12’de 11, düşük risklerde 3’te 2 tespit)
HPV ve Yöntem Uyumsuzlukları
Pubmed’de >400 den fazla yayın HPV tayin ve genotiplemedeki yöntem farklılıklarını incelemiştir.
ilk yayın 1989 yılında;
In situ hibridizasyon yönteminin Slot blot ve souther blot’tan daha iyi olduğu rapor edilmiş.
Günümüzde;
PCR yöntemi Gold-standart
Kaynak:Obstet Gynecol. 1989 Oct;74(4):673-8.
HPV Tanı Yöntemleri
Classification to HPV tests
NÜKLEİK ASİT HİBRİDİZASYON TESTLERİ
Belirli sayıda üretici bulunmaktadır.
INNO-LİPA HPV (Fujirebio): 14 HPV tipini saptıyor. Ancak içinde yüksek risklerden 35,39,52,66 bulunmuyor.
Avantajı: Düşük volümlü ve sınırlı teknolojiye sahip laboratuvarlarda da yapılabilmesi
Dezavantajı: Sensitivite düşük
Tüm yüksek riskleri kapsamıyor
Prosedür zaman alıcı ve oyalayıcı
Büyük miktarda saf DNA gerekiyor
SİNYAL AMPLİFİKASYON TESTLERİ
Avantajı: Kantitatif sonuç da alınabilmesi FDA onaylı test var
Yanlış pozitiflik oranı düşük
Genotip ayrımında duyarlılık yüksek
Dezavantajı: Lisanslı ve patentli teknolojiler
Fazla üretici yok
Bu nedenle maliyet yüksek
SİNYAL AMPLİFİKASYON TESTLERİ
Hybrid Capture® 2 HPV (Digene):
İlk FDA onaylı kit (2003)
13 yüksek riskli tipi ayırt edebiliyor
Birden fazla tip pozitif ise, ayrım yapamıyor
Tek onkojenik tiplerin belirlenmesi önemli
Çünkü Tip-16 ve Tip-18’in prekanseröz lezyon
oluşturma riski %10-15, diğer tipler için %3 denilmekte
Bazı çalışmalarda, HPV 16 ve 18’in servikal
Ca’lerin %70’inden sorumlu olduğu belirtilmekte
SİNYAL AMPLİFİKASYON TESTLERİ
Cervista HPV (Hologic)
FDA onaylıdır (2011)
14 yüksek tipi saptıyor
Servikste orta derece displaziyi gösteren CIN2
lezyonlarda duyarlılığı %98, CIN3 lezyonlarda %100’dür
NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ
• PCR
• Real-Time PCR
• Microarray
• Genome sequencing (Sekans analizi) Çoğu test bu yöntemlerle yapılmaktadır
NÜKLEİK ASİT AMPLİFİKASYON TESTLERİ
Avantajları:
• Fleksibl teknoloji • Çok yüksek sensitivite Dezavantajları:
• Bazı genotiplerde zayıf sinyal alınması
• Kontaminasyon nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar alınabilmesi
PCR Tekniği
• Düşük kopya sayısı bulunan örneklerde çoklu tip pozitif ise, yanlış negatif sonuçlar olabilmekte
• Tüm HPV genotipleri saptanamayabilir
• Birden fazla HPV genotipi içeren örneklerde birden fazla amplifikasyon oluşabilir ve tip ayrımı zorlaşabilir
Real- Time PCR Tekniği
Piyasada kullanılan çoğu test bu gruptadır.
Roche COBAS® 4800 HPV:
FDA onaylıdır (2011)
14 yüksek riski tarama şeklinde saptıyor
Tip 16 ve 18’i ayrı ayrı saptıyor
Bir genotipleme kiti değildir, tarama kitidir
Tip 16 ve 18 için genotipleme yapmaktadır
Diğer tiplerden biri pozitif ise, test sonucunu POZİTİF olarak
vermektedir, ancak tip belirtememektedir
CIN 2 lezyonları için klinik sensitivitesi %90, spesifitesi ise %70’tir
Real- Time PCR Tekniği
Aptima HPV Assay (Hologic):
FDA onaylıdır (2011)
14 yüksek riski saptamaktadır
Ancak tipler arasında ayrım yapamamaktadır
Bir genotiplendirme kiti değildir, tarama kitidir
Farklılığı, onkojenik potansiyeli gösteren E6 ve E7 mRNA genlerini de saptaması ve FDA onayı almasıdır
Real- Time PCR Tekniği Abbott Real-Time HPV Assay:
FDA onayı yoktur
14 HPV tipini taramakta,
Tip 16 ve 18’i ayrı ayrı saptamaktadır Bir genotiplendirme kiti değildir, tarama kitidir
Microarray Testleri
Duyarlılığı değişmektedir
Üreticilere göre saptadığı tip sayısı değişmektedir
Saptanan tip sayısı 36’ya kadar çıkabilmektedir
Dezavantajı, belirli sayıda testi biriktirerek topluca çalışma zorunluluğudur
Özel Microarray okuma platformu gerekmektedir
Maliyet yüksek seyretmektedir
Microarray Testlere Örnekler
Roche Linear Array®: 36 HPV tipini belirliyor
Clinical Arrays® HPV (Genomica): 35 HPV tipini belirliyor
CLART® HPV-2 (Genomica): 35 HPV tipini belirliyor
HPV 9G DNA Chip (Biometrix, Kore): 19 HPV tipini belirliyor (14 yüksek risk, 5 düşük risk)
Karşılaştırmalı Çalışmalar
356 servikal sürüntü örneğinde:
• Roche Cobas HPV,
• Abbott Real-Time HPV,
• Digene Hybrid Capture 2 HPV (Signal amplification) Referans yöntem olarak Dizi Analizi (Genome sequencing) kabul edilmiş
Üç yöntemin birbiriyle uyum oranı %82.6
Abbott RT ve Roche COBAS HPV uyum oranı %89.6 Abbott RT HPV’nin HC 2 ile uyumu %86.1
Roche Cobas HPV’nin HC2 ile uyumu %89.6’dır
Referans Yöntem Olarak Kabul Edilen Sekans Analizine Göre Oranlar
Yöntem Sensitivite Spesifite
Hybrid Capture 2 (Digene) %96.6 %89.1
Roche Cobas HPV %91.7 %97.0
Abott RealTime PCR %78.3 %99.2
Karşılaştırmalı Çalışmalar
214 Servikal Sürüntü Örneğinde:
Roche Cobas HPV ile Biometrix HPV 9G DNA
Microarray testleri karşılaştırılmış
İki yöntem arasında uyum %81.7
HPV 16 ve 18’i saptayabilme oranı % 97.2
Yüksek riskli genotiplerde sensitivite iki yöntemde de %100 bulunmuş
En İyi Yöntem Hangisidir?
FDA’in yayınladığı makaleye göre:
Gold standart yöntem DNA dizi analizi (Genome
sequencing) olarak belirtiliyor
Çünkü sekans analizi:
Tüm HPV tiplerini tanımlayabilen ve örnekteki tüm varyantları gösterebilen tek yöntemdir.
Dezavantajı, pahalı ekipmanlar gerektirmesi, deneyimli personele sahip olma sorunluluğu ve yoğun uğraş gerektiren bir yöntem olmasıdır.
Bu nedenle de, çok az laboratuvar bu yöntemi kullanabilmektedir.
SONUÇ:
• Yöntemler arasında tam bir uyum yakalamak oldukça zordur
• Bazı Real-Time PCR kitleri tüm HPV tiplerini taramaktadırlar
• Sekans analizi ile tüm HPV tiplerini taramak ve tiplendirmek mümkündür
SONUÇ:
• Çeşitli firmalara ait ticari kitler ise, yalnızca belirli tipleri taramaktadırlar
• Çoğunlukla da yüksek tipleri taramaktadırlar
• Bu fark nedeniyle, POZİTİF’lik ve NEGATİF’lik oranları değişmektedir
Kabul Edilebilir Bir HPV Tarama Kiti Nasıl Olmalıdır?
En azından 14 yüksek riskli tipi tarayabilir özellikte olmalıdır
Daha Fazla Tercih Edilebilir Bir HPV Tarama Kiti:
14 tip dışındaki diğer muhtemel yüksek riskli tipleri ve ayrıca, olabildiğince düşük riskleri de tarayabilir özellikte olmalıdır
Kabul Edilebilir Bir HPV Genotiplendirme Kiti:
En azından HPV Tip 16 ve Tip 18’i ayrı ayrı belirleyen özellikte olmalıdır
Daha Fazla Tercih Edilebilir Bir HPV Genotiplendirme Kiti:
14 yüksek risk dışında, muhtemel yüksek riskleri ve bir kısım düşük riskleri de ayrı ayrı belirleyebilir özellikte olmalıdır
Biz Nasıl Bir Yol İzliyoruz?
• İlk adım olarak tüm tipleri tarayan Real-Time PCR aşamasını kullanıyoruz
• Pozitif bulunan örnekleri:
– Kantitatif genotiplendirme sonucu isteniyorsa, DNA Technology’nin 18 yüksek risk, 3 düşük risk olmak üzere toplam 21 tipi ayrı ayrı ve kantitatif olarak belirleyen RealTime PCR genotiplendirme çalışmasına alıyoruz
– Tüm tipler kalitatif genotiplendirme olarak isteniyorsa, ABI sekans analizörü ile sekans çalışmasına alarak tiplendirme yapıyoruz.